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点击图片查看原图一．Pull down 的概念
在Pull down实验中，带标签的诱饵蛋白能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获，形成“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。纯化产物洗脱后，经Western blot验证或LC-MS/MS，即可证明或鉴定与诱饵蛋白互作的蛋白。
二．Pull down实验流程
图1.Pulldown流程示意图
三．Pull down实验方案设计
1、构建含His或GST标签的诱饵蛋白原核表达载体；
2、原核表达诱饵蛋白（我们采用自诱导培养基培养细菌，能有效降低包涵体的形成）；
3、细菌裂解液过柱，带标签的诱饵蛋白被固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”；
4、待测样品裂解液过柱孵育，与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附；
5、清洗，离心，去除未结合的杂蛋白；
6、洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物；
7、如要验证某蛋白X与诱饵蛋白互作，则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育，做Western blot验证即可；
8、如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白，则需将6.所得的蛋白复合物做LC-MS/MS鉴定；
四．生物信息学分析
在Pull down实验中，带标签的诱饵蛋白能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获，形成“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。纯化产物洗脱后，经Western blot验证或LC-MS/MS，即可证明或鉴定与诱饵蛋白互作的蛋白。
二．Pull down实验流程
图1.Pulldown流程示意图
三．Pull down实验方案设计
1、构建含His或GST标签的诱饵蛋白原核表达载体；
2、原核表达诱饵蛋白（我们采用自诱导培养基培养细菌，能有效降低包涵体的形成）；
3、细菌裂解液过柱，带标签的诱饵蛋白被固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”；
4、待测样品裂解液过柱孵育，与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附；
5、清洗，离心，去除未结合的杂蛋白；
6、洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物；
7、如要验证某蛋白X与诱饵蛋白互作，则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育，做Western blot验证即可；
8、如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白，则需将6.所得的蛋白复合物做LC-MS/MS鉴定；
图2.Pulldown实验流程图
四．生物信息学分析
GO注释统计
Pathway分析
五．Pull down实验技术服务内容
1、原核表达载体构建；
2、融合蛋白的诱导表达与纯化；
3、pull down捕获互作蛋白；
4、Western blot验证或LC-MS/MS鉴定互作蛋白；
5、数据检索、生物信息学分析；
6、结果分析与报告整理。
六．订购pulldown技术服务须知
为保证pull down实验顺利进行，请告知您的研究背景和目的，并提供目的蛋白对应的mRNA序列或对应基因的NCBI登录号，及拟用的融合标签。
七．实验周期及费用：咨询本公司。
